干酪乳杆菌发酵及热加工方式对小麦蛋白抗原性的影响（一） 对于这些疾病患者而言

小麦过敏、干酪工方乳糜泻、乳杆热加非乳糜泻小麦敏感(NCGS)等“小麦相关疾病”在世界各地的菌发酵及发病率在不断上升。对于这些疾病患者而言。式对避免摄入小麦致敏蛋白是小麦性唯一且有效的方法圈。除探究过敏机制、蛋白寻找治疗的抗原突破点外，研发低致敏性的影响小麦食物成为当前亟待解决的问题。乳酸菌在发酵过程中通过自身的干酪工方蛋白质水解系统降解相关蛋白质及多肽，并通过产酸改变发酵面团的乳杆热加pH值以激活面粉的内源性蛋白酶.进一步加强蛋白质的降解。在蛋白质降解为多肽及氨基酸时，菌发酵及既改变了面团风味，式对也改变了致敏蛋白的小麦性含量。此外，蛋白乳酸菌代谢产生的抗原抗真菌物质可以延长产品货架期，产生的胞外多糖可以改善面团的品质。鉴于此，乳酸菌发酵作为一种很有前景的发酵方式，值得进一步的探究。乳酸菌种类繁多，目前对于其降低小麦蛋白抗原性的研究多集中于植物乳杆菌发酵方面。干酪乳杆菌被证实具有细胞被膜蛋白酶，而这种酶在降解蛋白质的过程中起到很重要的作用。此外，大量研究表明加工方式影响食物蛋白的抗原性，目前用于降低食物蛋白抗原性的加工方法主要有热加工(蒸煮、烘烤等)和非热加工(发酵、酶解、超声等)。蒸煮等热加工方式会改变食物蛋白的构象结构，从而改变抗原的构象表位。而抗原蛋白线性表位的破坏主要发生在发酵和酶解过程中。Rao等研究发现低温烘烤和水煮能够产生较低致敏性的花生。Rui等利用植物乳杆菌发酵降低了大豆分离蛋白的抗原性。利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶连续酶解降低了小麦中致敏谷蛋白含量。本研究利用分离自老面中的1株干酪乳杆菌发酵面团，研究其对小麦致敏蛋白含量及抗原性的影响，研究加工条件与抗原性之间的关系，为开发低致敏性小麦制品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

革兰氏染色试剂盒、细菌组DNA提取试剂盒、乳酸杆菌选择性琼脂、Bradfbrd蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE分离/浓缩胶缓冲液、预染蛋白Maker、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、AP-羊抗兔二抗、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒。北京索莱宝科技有限公司：EL-TMB显色试剂盒，上海生工生物：试验所用试剂均为分析纯级，兔过敏血清由实验室自制。

1.2 主要仪器

PCR热循环仪，杭州晶格科学仪器有限公司；凝胶成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司；Mul-tiskanFC酶标仪，上海赛默飞公司；mini-proteanⅡ凝胶仪，美国伯乐公司。

1.3 试验方法

1.3.1 干酪乳杆菌的分离鉴定

称取酸面团样品5g于无菌均质袋中，加入45mL灭菌后的蛋白胨水(1％蛋白胨，0.43％NaCl，0.72％Na₂HP0₄，0.36％KH₂PH0₄，pH7.0)，混匀后梯度稀释，取10^-5～10^-7稀释梯度，涂布于乳酸杆菌选择性琼脂培养基，37℃培养24h。随机挑取菌落进行过氧化氢酶和革兰氏染色试验。取过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性且镜检为杆状的菌株进行进一步分子鉴定。

采用细菌组DNA提取试剂盒提取所分离菌株的DNA，利用细菌通用引物27F(5’-AGCG-GATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTrGTACGA-3’)和1492R(5’-GCAGAGTTCTCGGAGT.CACGAAGAGTlTI’GATCCTGGCTCAG-3’)通过PCR反应对16SrRNA基因进行扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5min：94℃变性30s。55℃退火30s，72℃延伸5min，35个循环：72℃充分延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送于北京生工生物工程有限公司测序。所得序列与NCBI文库比对后，用MegaX构建进化树。

1.3.2 菌株生长曲线和菌落数与0D值对应关系的测定

取一支冻存菌种于MRS液体培养基中，37℃下活化24h。取O.5mL活化菌液于6个分别装有30mLMRS肉汤的三角瓶中。37℃培养0，4，8，12，16，20h，在波长600nm处测量各时段菌液吸光度值，绘制生长曲线。

取活化菌液用MRS肉汤稀释2，2.5，3，4，5，6倍，测定0D600nm值，并梯度稀释，倾注于MRS琼脂中，37℃培养48h后计算活菌数。

1.3.3 酸面团的制备

取指数生长期菌液，6000×g离心10min，生理盐水洗涤2次，双蒸水重悬浮至50mL，调节OD‰值为0.8。100g面粉与50mL菌悬液投入和面机。和面15min，面团内菌体数量约为108CFU/g。发酵温度30℃，相对湿度80％。发酵24h，定时取样。

1.3.4 发酵过程中pH值、可滴定酸度(TTA)和面团蛋白含量的测

每隔2h取样，于无菌均质袋中10倍稀释后混合均匀，测定pH值并用0.1mol/LNa0H滴定至pH值为8.3，记录所消耗Na0H的体积数即，TTA值。

将发酵面团样品冻干后磨粉于-20℃保存。蛋白提取参照Prado等的方法。具体操作如下：向500mg面粉中加入10mL％s-HCl缓冲液(50mm01，L，pH8.8)，于4℃下搅拌1h，20000×g，4℃离心20min，收集上清液(清蛋白和球蛋白)；沉淀用5mL缓冲液洗涤3次，加入10mL75％乙醇，室温下搅拌1h，离心20min，收集上清液(醇溶蛋白)；采用5mL75％乙醇洗涤沉淀3次，加入10mL50mmol/LTris-HCl(pH8.8，1％SDS，0.5％DTT)，4℃搅拌2h，离心20min，收集上清液(谷蛋白)。采用考马斯亮蓝法测蛋白质质量浓度。

1.3.5 SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析

参照Rao等的方法，具体操作如下：制备12％的分离胶和5％的浓缩胶，样品溶液稀释为相同浓度后与5x上样缓冲液混合并沸水加热5min，进样后进行垂直电泳(浓缩胶电压80V，分离胶电压110V)，电泳结束后采用考马斯亮蓝R250染色，脱色后于凝胶成像系统拍照。

未染色的电泳胶转移至硝酸纤维素膜上(300mA冰浴下转膜90min)，丽春红染色确认转膜成功。加入5％脱脂奶粉，摇床上摇动封闭2h；加入稀释的-抗(抗小麦蛋白兔血清)，4℃下孵育过夜；TBST缓冲液(0.02mol/LTBS，0.05％Tween-20，pH7.6)洗膜后，加入稀释的AP-羊抗兔二抗，室温下孵育90min；洗膜后。利用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色。

1.3.6 不同发酵方式及热加工方法制作馒头

向100g面粉(乳酸菌菌落数108～109CFU/g)中加入50mL菌悬液和0.35g安琪酵母调制面团后分别发酵。冷藏发酵条件为：4℃发酵3d后于37℃，80％相对湿度发酵60min：一次发酵条件为：37℃，80％相对湿度发酵60min；二次发酵条件为：中种面团(60g面粉，0.35g酵母，30mL菌悬液)于37℃发酵4h后加入40g面粉和20mL水继续发酵1h。发酵好的3种面团用于烤制(180℃，20min)和蒸制(沸水蒸制20min)。取样冻干，磨粉备用。

1.3.7 蛋白含量及酶联免疫吸附试验测

总蛋白提取参照Akagawa等的方法，具体操作如下：25mg面粉加入1mL蛋白提取液[40mmol/LTris，8mol/L尿素，4％3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(cHAPs)，冰浴下超声提取30s，6次；4℃下16000×g离心20min，收集上清液，考马斯亮蓝法测蛋白质量浓度。

采用酶联免疫吸附试验评价样品抗原性。使用50mmol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释蛋白至5μg/mL，按100μL孔加入酶标板，4℃静置过夜；用TBST洗板4次，按150μL/孔加入1％BSA封闭液，37℃温育2h；TBST洗板后按100μL/孔加入使用1％BSA稀释的抗小麦蛋白兔血清稀释液(1:10000)，37℃温育2h，洗板；按100μL/孔加入500倍稀释的羊抗兔HRP-IgG，37℃温育1h，洗板；使用TMB显色试剂盒显色，于波长450nm处测0D值。

1.4 数据分析

试验数据用SPSS软件处理，图由GraphPadPrism绘制。

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